高效液相色譜(HPLC)又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

作為實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的精密儀器之一，其使用頻率較高，其已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

在這里，小編整理了高效液相色譜(HPLC)使用過(guò)程中常見(jiàn)的日常維護(hù)和保養(yǎng)方法，希望給用戶(hù)的日常使用提供一定的參考價(jià)值。

流動(dòng)相及樣品的制備要求

? 高效液相級(jí)色譜醇，二次蒸餾水，緩沖鹽一定要過(guò)濾，且流動(dòng)相需要定期更換；

? 流動(dòng)相脫氣至關(guān)重要(可采用抽濾，超聲波脫氣等方法)；

? 樣品溶解后，用0.22微米的有機(jī)系膜或者水系膜過(guò)濾。

高壓恒流泵的維護(hù)和保養(yǎng)

高壓恒流泵為整個(gè)色譜系統(tǒng)提供穩(wěn)定均衡的流動(dòng)相流速，保證系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行和系統(tǒng)的重現(xiàn)性。高壓輸液泵由步進(jìn)電機(jī)和柱塞等組成，高壓力長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)行回逐漸磨損泵的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在升高流速的時(shí)候應(yīng)梯度升高，最好每次升高0.2mL/min，當(dāng)壓力穩(wěn)定時(shí)再升高，如此反復(fù)直到升高到所需流速。

特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流動(dòng)相通過(guò)吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇或甲醇超聲波清洗；清洗不成功則需要更換。在儀器使用完了以后，要及時(shí)清洗管路并沖洗泵，保證泵的良好運(yùn)轉(zhuǎn)環(huán)境，保證泵的正常使用壽命。

色譜柱的維護(hù)和保養(yǎng)

? 所使用的流動(dòng)相均應(yīng)為HPLC級(jí)或相當(dāng)于該級(jí)別的，在配置過(guò)程中所有非HPLC級(jí)的試劑或溶液均經(jīng)0.22um薄膜過(guò)濾，而且流動(dòng)相使用前都經(jīng)過(guò)超聲儀超聲脫氣后才使用。

? 所使用的水必須是經(jīng)過(guò)蒸餾純化后再經(jīng)過(guò)0.22um水膜過(guò)濾后使用，所有試液均現(xiàn)用現(xiàn)配；并且在進(jìn)樣的樣品都必須經(jīng)過(guò)0.22um薄膜針筒過(guò)濾后進(jìn)樣。

? 所使用到的最大流速為1.0mL/min，所以流速提升過(guò)程應(yīng)是梯度提升，不存在流速的突升突降。

? 儀器檢測(cè)完，需要用流動(dòng)相梯度洗脫色譜柱1小時(shí)以上。

工作站的維護(hù)

出現(xiàn)死機(jī)可重啟計(jì)算機(jī)；不正常運(yùn)行時(shí)，首先可更換電腦測(cè)試其硬件故障；或在本機(jī)上重新插拔接口、重新安裝軟件。

柱壓?jiǎn)栴}

柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa 以?xún)?nèi)或在50PSI之間（在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。

? 壓力過(guò)高

這是高效液相在使用中最常見(jiàn)的問(wèn)題，指的是壓力突然升高。

1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查：

(1)首先斷開(kāi)真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿(mǎn)液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過(guò)濾頭正常，在檢查；

(2)打開(kāi)Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子，如果壓力沒(méi)有明顯下降，則是過(guò)濾白頭堵塞。處理方法：將過(guò)濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI以下，過(guò)濾白頭正常，在檢查；

(3)把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。問(wèn)題無(wú)法解決可考慮更換色譜柱。

2、流速設(shè)定不正確：可重新設(shè)定正確流量。

3、流動(dòng)相配比不正確：不同配比的流動(dòng)相其黏度系數(shù)不相同，較高黏度的流動(dòng)相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。

4、系統(tǒng)壓力零點(diǎn)漂移：調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點(diǎn)。

? 壓力過(guò)低

1、一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當(dāng)力擰緊或襯四氟薄膜。

2、泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無(wú)法吸上液體。處理方法：打開(kāi)Purge閥，用3~5ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專(zhuān)用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

3、無(wú)流動(dòng)相流出：檢查儲(chǔ)液瓶中有無(wú)流動(dòng)相，沉子是否浸在流動(dòng)相中，泵是否運(yùn)行。

4、參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。

基線問(wèn)題

? 基線漂移

基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問(wèn)題，在實(shí)際工作中，我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況，特別是在梯度洗脫的時(shí)候，基線漂移是常有的事。一般說(shuō)來(lái)，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要30min的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下(220nm)平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但如果你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：

1、柱溫波動(dòng) 控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開(kāi)的窗戶(hù)或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。

2、流通池被污染或有氣體 用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池(最好斷開(kāi)柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。

3、紫外燈能量不足：更換新的紫外燈。

4、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。 檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑。

? 基線噪音

對(duì)于紫外檢測(cè)器，氘燈光源打開(kāi)后要預(yù)熱30min以上，基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測(cè)物無(wú)關(guān)的檢測(cè)器輸出信號(hào)的隨機(jī)擾動(dòng)變化，分短期噪聲和長(zhǎng)期噪聲兩種。

氘燈用的過(guò)久，接近壽命期時(shí)(氘燈的壽命約1000h), 會(huì)使基線噪音明顯增加, 應(yīng)及時(shí)更換氘燈。除光源外, 流路中的氣泡也會(huì)產(chǎn)生噪音。對(duì)于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是來(lái)自流路中的氣泡的問(wèn)題，可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪聲立即停止，基線呈一條直線，說(shuō)明基線噪聲來(lái)自流動(dòng)相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣；若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問(wèn)題。

保留時(shí)間

保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無(wú)規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)上，保留時(shí)間漂移的多半原因是由于不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失(例如通過(guò)水解)，色譜柱污染(由樣品或流動(dòng)相所致)等。保留時(shí)間漂移的幾種最常見(jiàn)的原因和解決方法如下：

? 色譜柱平衡

如果觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。通常平衡需要10-20個(gè)柱體積的流動(dòng)相,但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑(如離子對(duì)試劑)則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意:水是很容易污染的流動(dòng)相成分。

? 固定相穩(wěn)定性

固定相的穩(wěn)定性都是有限的,即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用,固定相也會(huì)慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性最好，水解速度與流動(dòng)相類(lèi)型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

? 色譜柱污染

保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見(jiàn)原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過(guò)濾器，它可以過(guò)濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。

通常通過(guò)實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來(lái)源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)，如：配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類(lèi)脂類(lèi)化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。

通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加，可以通過(guò)使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來(lái)去除樣品基質(zhì)的影響，避免色譜柱污染最簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下，找到問(wèn)題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。

通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解，DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。

? 流動(dòng)相組成

流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見(jiàn)原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等，應(yīng)防止流動(dòng)相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過(guò)15s，超過(guò)了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無(wú)法進(jìn)行定性。

峰型異常問(wèn)題

峰型問(wèn)題是液相的主要問(wèn)題，在做液相過(guò)程中，我們就是要變換不同的條件來(lái)改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問(wèn)題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。

? 色譜圖中未出峰

系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；檢測(cè)器設(shè)置不正確；針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。

? 一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰

流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。

? 所有峰均為負(fù)峰

信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒；光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。

? 所有峰均為寬峰

系統(tǒng)未達(dá)到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類(lèi)型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。

? 所出峰比預(yù)想的小

樣品黏度過(guò)大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測(cè)器設(shè)置不正確．定量環(huán)體積不正確；檢測(cè)池污染；檢測(cè)器燈出現(xiàn)問(wèn)題。

? 出現(xiàn)雙峰或肩峰

進(jìn)樣量過(guò)大；樣品濃度過(guò)高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

? 前伸峰

進(jìn)樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng)；保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。

①柱溫低：升高柱溫；

②樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：使用流動(dòng)相作為樣品溶劑；

③樣品過(guò)載：降低樣品含量；

④色譜柱損壞：更換柱子。

? 拖尾峰

柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對(duì)樣品進(jìn)行清潔過(guò)濾；調(diào)整流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼；加在線過(guò)濾器，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾；死體積或柱外體積過(guò)大，將連接點(diǎn)降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn)行再生。

? 出現(xiàn)平頭峰

檢測(cè)器設(shè)置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。

? 出現(xiàn)鬼峰

進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來(lái)平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理；流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過(guò)濾；盡可能使用HPLC級(jí)試劑；流路中有小的氣泡，打開(kāi)Purge閥，加大流速排除。

? 峰分叉

①保護(hù)柱或分析柱污染：取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析,如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞,拆下來(lái)清洗。如果問(wèn)題仍然存在,可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染,運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊?wèn)題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。

②樣品溶劑不溶于流動(dòng)相改變樣品溶劑,如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。

? 峰變形

樣品過(guò)載，減少樣品載量。

1、早出的峰變形：樣品溶劑選擇不恰當(dāng)

①減少進(jìn)樣體積；

②運(yùn)用低極性樣品溶劑。

2、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰：柱外效應(yīng)

①調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路)；

②使用小體積的流通池。

3、酸性或堿性化合物的峰拖尾：緩沖不合適

①使用濃度50～100 mM的緩沖液；

②使用Pka等于流動(dòng)相pH值的緩沖液。

4、額外的峰

(1)樣品中有其他組分：正常現(xiàn)象；

(2)前一次進(jìn)樣的洗脫峰：①增加運(yùn)行時(shí)間或梯度斜率；②提高流速；

(3)空位或鬼峰：①檢查流動(dòng)相是否純凈；②使用流動(dòng)相作為樣品溶劑；③減少進(jìn)樣體積。