什么是色譜柱？

色譜法是一種分離混合物中各組分的分析技術。色譜柱是色譜中使用的儀器的一部分。使用柱的五種色譜方法是氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、離子交換色譜(IEC)、尺寸排阻色譜(SEC)和手性色譜。色譜的基本原理可以應用于所有五種方法，其中，氣相色譜柱和高效液相色譜柱是使用率高的兩種方法。

? 氣相色譜柱

在氣相色譜中，流動相是氣體。氣相色譜柱的長度通常在1-100m之間。氣相色譜法(GC)：液相固定相結合或吸附到毛細管柱的表面上，或結合到柱內填充的固體載體上。匹配分析物和固定相的極性兩者具有相似的極性，固定相的厚度在0.1-8 μm之間，而厚度越厚，分析物的揮發性就越大。

? 高效液相色譜柱

高效液相色譜(HPLC)是液相色譜的一種。液相色譜柱共有三種基本類型：液-液、液-固和離子交換。液-液色譜柱不那么受歡迎，因為它們的穩定性有限且不方便。在液-固色譜柱中，固定相為固體，分析物吸收到固定相上，從而分析混合物的成分。通常，HPLC在分析柱之前有一個保護柱，以保護并延長分析柱的使用壽命。保護柱的作用是去除色譜柱上不可逆的顆粒物、污染物和分子等。

簡言之，色譜柱是裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。

色譜柱的分類

1、根據固定相極性的不同可分為極性色譜柱和非極性色譜柱；

2、根據固定相和流動相的相對極性的不同可分為正相色譜柱和反相色譜柱；

3、根據色譜柱填充劑的差別可分為硅膠柱、化學鍵合硅膠柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱、玻璃微球柱等。在化學鍵合硅膠柱中以十八烷基鍵合硅膠柱應用最廣泛，辛基硅烷鍵合硅膠柱次之，即通常所說的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用；

4、根據色譜柱內徑的不同，液相色譜柱可分為微徑柱、分析柱、快速柱、半制備柱、制備柱等，適用于不同的分離分析目的。常用的普通分析柱，內徑通常為4.6mm(3/16in )，柱長15-25cm，填料粒徑5-10pm，用于常規的分離分析。快速分析柱的內徑一般為6mm或更大，柱長30-80mm，填料粒徑為3pm或更小。半制備柱與制備柱，內徑一般在6mm以上，用于半制備或制備目的。而微徑柱內徑一般為1mm，甚至有更小內徑的毛細管柱，與常規分析柱相比，需要特殊的裝填技術，并配合高精度的微流泵(nano pump)使用。

液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。

簡言之，常見的分配柱填料有：碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(Octy/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、碳四柱(Butyl/C4)、碳一注(Methyl/C1)、陰離子交換柱(SAX)、陽離子交換柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)。常見的吸附柱填料：硅膠柱。

選擇合適的色譜柱材料非常重要，因為它直接關系到分析分離的質量和速度。舉例來講，對于填充柱而言，可選擇的固定相較多，柱容量較大，但是受柱長的限制，分離能力有限，主要應用于簡單化合物的分離。

色譜柱分離材料的種類非常多，常見的有硅膠、C18、C8、C4、NH2等材料。硅膠是最早使用的分離材料之一，它可以完全分離很多雜質和雜質成分。其缺點是在酸性和堿性環境下易受損。C18是目前使用較廣泛的分離材料之一，其特點是對疏水性的菲和芳香族化合物有很好的分離效果。C8、C4、NH2則以其適合分離的化合物不同而被應用。

不同的柱徑和柱長也會影響分離效果。一般而言，柱徑越小，分離效果越好；柱長越長，則分離時間越長，分離效果越好。分離效果與分辨率息息相關，分辨率即為兩個峰的最近出峰時間點與兩個峰高的平均寬度的比值。分辨率越高，兩個成分之間的差異越明顯，分離效果越好。

當然，除了色譜柱本身的選擇和使用方法外，樣品前處理過程的質量也是決定分離效果的關鍵因素之一。正確的樣品前處理過程能夠減少背景雜質的干擾，保證分離后的組分純度。

色譜分離基本原理

在色譜法中存在兩相，一相是固定不動的，叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，叫做流動相。其分離原理就是利用待分離的各種物質在兩相中的分配系數、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的。

高效液相色譜儀的分離原理

含有樣品的流動相液體通過固定于柱子或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面；當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，混合物中的各組分與固定相發生相互作用，由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。

各色譜柱分離原理

1、反相色譜柱

分離原理：用鍵合非極性基團的載體填充而成的色譜柱，根據物質極性差異進行分離，固定相的極性小于流動相的極性。

適用范圍：適用于大多數化合物,如蛋白質、肽、氨基酸、核酸、甾體、脂類、脂肪酸、糖類、生物堿等含有非極性基團的化合物。

常用色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)、苯基鍵合硅膠、硅膠等。

2、正相色譜柱

分離原理：用硅膠或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱，根據物質極性差異進行分離。固定相的極性大于流動相的極性(也可使用含水流動相，HILIC)。

適用對象：適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，如脂溶性維生素、甾體激素等。

常用色譜柱：硅膠、氨基鍵合硅膠、氰基鍵合硅膠等。

3、離子交換色譜柱

分離原理：以離子交換樹脂或化學鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇系數的差別而實現分離。

適用對象：適用于離子或可離解的化合物，如無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白質等。

常用色譜柱：有機共聚物樹脂、硅膠微球離子交換劑、螯合樹脂等。

4、分子排阻色譜柱

分離原理：根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關系，對溶質進行分離，大分子的物質保留弱。

適用對象：用于分析多肽、蛋白質、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等。

常用色譜柱：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物、高交聯度苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物。

5、手性拆分色譜柱

分離原理： 由具有光學活性的單體，固定在硅膠或其他聚合物上制成手性固定相，通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異，從而實現光學異構體的拆分。

適用對象：光學異構體。

常用色譜柱：纖維素、環糊精、大環抗生素、蛋白質等。

不同色譜柱的清洗方法

高效液相色譜柱是消耗品，會隨使用時間或進樣的次數增加，出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰，柱效下降。需要定期進行清洗和再生，不同的色譜柱清洗方法各不相同。

? 反相柱

分別用甲醇:水=90:10，純甲醇(HPLC級)，異丙醇(HPLC級)，二氯甲烷(HPLC級)等溶劑作為流動相，依次沖洗，每種流動相流經色譜柱不少于20倍的色譜柱體積，然后再以相反的次序沖洗。

? 正相柱

分別用正己烷(HPLC級)，異丙醇(HPLC級)，二氯甲烷(HPLC級)，甲醇(HPLC級)等溶劑做流動相，順次沖洗，每種流動相流經色譜柱不少于20倍的柱體積(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高)，注意使用溶劑的次序不要顛倒，用甲醇沖洗完后，再以相反的次序沖洗至正己烷，所有的流動相必須嚴格脫水。

? 離子交換柱

長時間在緩沖溶液中使用和進樣，將導致色譜柱離子交換能力下降，用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。

另外，還可以選擇能溶解柱內污染物的溶劑為流動相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復到新柱的水平的。如果柱子裝反了，可以調回來，但可能會造成柱內擔體塌陷，在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。