色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異)，先將它們分離，后按一定順序檢測(cè)各組分及其含量的方法。

? 色譜法的分離原理

當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同，在同一推動(dòng)力作用下，各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術(shù)，稱為色譜法。

? 流動(dòng)相

色譜分離過(guò)程中攜帶組分向前移動(dòng)的物質(zhì)。

? 固定相

色譜分離過(guò)程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

? 色譜法的特點(diǎn)

(1)分離效率高，復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體；

(2)靈敏度高，可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量；

(3)分析速度快，一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析；

(4)應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析；

(5)高選擇性，對(duì)性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力。不足之處是被分離組分的定性較為困難。

? 色譜分析法的分類

(1)按兩相狀態(tài)分類

a.氣相色譜(Gas Chromatography, GC)

流動(dòng)相為氣體(稱為載氣)。常用的氣相色譜流動(dòng)相有N2、H2、He等氣體，按分離柱不同可分為填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為氣固色譜和氣液色譜。

b.液相色譜(Liquid Chromatography, LC)

流動(dòng)相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為液固色譜和液液色譜。

c.超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

流動(dòng)相為超臨界流體。一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的一種新型的色譜分離分析技術(shù)，不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

(2)按操作形式分類

a.柱色譜(Column Chromatography, CC)

固定相裝在柱管內(nèi)，包括填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。

b.紙色譜(Paper Chromatography, PC)

固定相為濾紙；采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開(kāi)而進(jìn)行分離。

c.薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)

固定相壓成或涂成薄層，操作方法同紙色譜。

(3)按分離原理分類

a.吸附色譜(Absorption chromatography)

b.分配色譜(Partition Chromatography)

c.離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)

d.凝膠色譜(Gel Chromatography)

? 色譜圖

組分在檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以又叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分稱為色譜峰。

? 色譜保留值

色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測(cè)組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分，在柱中的滯留時(shí)間越長(zhǎng)，或者說(shuō)將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大。所以保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)來(lái)描述。

? 色譜圖上的色譜流出曲線

根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)。根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析；根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)色譜柱的分離效能；根據(jù)兩峰間的距離，可評(píng)價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。

? 分配比

在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。

? 在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定？為什么這樣說(shuō)？

是因?yàn)榉峙湎禂?shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定，兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng)力學(xué)因素，反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?形狀)。

? 色譜理論需要解決的問(wèn)題

色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。

? 組分保留時(shí)間為何不同？

色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。

? 色譜峰為何變寬？

色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散作用)。塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

(1)塔板理論

引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo)。不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無(wú)法分離。不足之處在于其基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過(guò)程。塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能說(shuō)明色譜峰為什么會(huì)變寬，同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

(2) 速率理論

組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素，是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最合適的條件才能使柱效達(dá)到最高。

? 色譜定性方法

(1)定量校正因子

試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即：mi = fi’?Ai。

(2)絕對(duì)校正因子

比例系數(shù)f i，單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量：f i’=m i / Ai 。

(3)相對(duì)校正因子fi

即組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。

(4)常用的幾種定量方法

a.歸一化法

歸一化法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

b.外標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高，操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。

c.內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大。每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，則：wi=Ai/As*常數(shù)。其內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：

(a)試樣中不含有該物質(zhì)；

(b)與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近；

(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；

(d)出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近，且能分離開(kāi)；

(e)加入量適中并與待測(cè)組分接近。